INTRODUÇÃO. Alicyclobacillus spp. gênero é composto de bactérias ácido-termorresistentes, aeróbicas, em forma de bacilos, Gram-positivas, capazes de produzir esporos, não patogênica, atua como deteriorante de sucos cítricos e alimentos. O processo de deterioração do suco foi descrito pela primeira vez em 1981, em suco de maçã com alterações de sabor e odor, devido à habilidade do Alicyclobacillus acidoterrestris 0244T em produzir 2-metoxifenol (guaiacol) e 2,6 dibromofenol. A composição da membrana, composta por ácidos graxos cíclicos confere resistência à temperatura entre 25 a 70 °C e pH (2,0 a 6,5), o que juntamente com a capacidade de formar esporos, resistente causa problemas para a indústria, com consequente perdas econômicas. De acordo com o USDA (Departamento de Agricultura dos Estados Unidos), considerando a média das cinco últimas safras de laranja, o Brasil é responsável por 34% da safra de laranja e mais da metade da produção de suco de laranja no mundo, portanto, este país foi responsável por 76% do mercado global de suco de laranja em 2017. A exportação de suco de laranja concentrado (66 ºBrix) contribui significativamente para a balança comercial do país e garantir a qualidade do suco concentrado e reconstituído, aumentar a vida útil e buscar substâncias naturais para evitar o desenvolvimento de espécies bacterianas é essencial para este setor. Tabernaemontana catharinensis (A. DC.) pertence à família Apocynaceae, é uma árvore lactescente, encontrada no Brasil, na Argentina, no Paraguai e no Uruguai, utilizada na medicina popular como antídoto para picadas de cobra, alívio de dor de dente e vermífugos. Apresenta ação biológica como antinociceptiva, anti-inflamatória, antimicrobiana, tripanocida, antiviral, antimicobacteriana e antileishmaniose. A planta T. catharinensis (A. DC) tem células laticíferas vivas que secretam látex, uma emulsão aquosa com várias substâncias químicas e vários compostos bioativos, como polifenóis e flavonóides, que são secretados em resposta a danos nos tecidos da planta.
OBJETIVO. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana do látex bruto de Tabernaemontana catharinensis (A. DC.), em microrganismos do gênero Alicyclobacillus spp..
MATERIAL E MÉTODOS. Linhagens microbianas e condições de crescimento: A. acidoterrestris 0244T, A. hesperidum 0298T, A. acidiphilus 0247T, A.cicloheptanicus 0297T e A. acidocaldarius 0299T. O meio de crescimento utilizado nos experimentos foi Bacillus acidoterrestris (BAT) Deinhard et al., (1987). O suco de laranja concentrado, 66 ºBrix, pH 4,0, foi fornecido por uma indústria de suco de cítricos localizada na região noroeste do Paraná, Brasil, e hidratado com água destilada estéril em condições higiênicas, livre de Alicyclobacillus spp. e esporos, certificados em nosso laboratório. Aquisição e preparo do látex bruto: T. catharinensis (A. DC) - amostras brutas de Apocynaceae foram coletadas em 2016 de plantas cultivadas no campus da Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brasil. Látex foi obtido por incisões superficiais em caule T. catharinensis (A. DC.), coletado em uma solução de água de mesmo volume. As amostras foram centrifugadas (5,000 x g) a 10 °C durante 25 minutos. O depósito foi reservado, o sobrenadante foi liofilizado e usado nos experimentos. A parte que abrange quase todos os compostos de látex solúvel foi denominada látex bruto de T. catharinensis (A. DC.). Determinação de concentrações bactericidas inibitórias e mínimas: Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) para látex bruto foi determinada em placas de microdiluição de 96 poços (TPP®, Suíça), seguindo a metodologia do
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National Committee for Clinical Laboratory Standards ( NCLSI M7-A9) (2012). Análise de citotoxicidade: T. catharinensis (A. DC.) foi realizada pelo modo colorimétrico, MTT (brometo de 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) 2,5-difeniltetrazio), descrito por Mosmann (1983). Microscopia eletrônica de varredura: A. acidoterrestris 0244T células foram cultivadas com látex bruto de T. catharinensis (A. DC.) em concentrações 1 x MIC, 4 x MIC e 8 x MIC em suco de laranja concentrado 66 °Brix, após reconstituição de água destilada , 11 °Brix, pH 4,0. O volume da cultura em cada microtubo foi de 1 mL e a concentração inicial do inóculo foi de 104 UFC/mL. Os microtubos foram incubados a 45 ºC por 24 horas. Após a incubação, as células A. acidoterrestris foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,2 e fixadas com glutaraldeído a 2,5% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em tampão cacodilato de sódio 0,1 M , Hatfield, PA) durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram retiradas da solução de endurecimento, lavadas duas vezes com tampão cacodilato 0,1M e colocadas em uma lamínula coberta com Poli-L-lisina durante 1 hora. As amostras foram lavadas três vezes com tampão cacodilato e posteriormente desidratadas utilizando-se concentrações progressivas de etanol (50, 70, 80, 90 e 100%). Posteriormente, foram submetidos ao ponto crítico de CO2 e cobertos por ouro, através do microscópio eletrônico de varredura QUANTA 250 (FEI Company).
RESULTADOS E DISCUSSÃO. Mínimo inibitório e concentrações bactericidas mínimas: CIM de látex bruto e CBM foram determinados contra espécies de Alicyclobacillus spp.. Pode-se observar CIM de 7,81 μg/mL para as cinco espécies de Alicyclobacillus analisadas. O CBM para as espécies A. acidoterrestris 0244T, A. hesperidum 0298T, A. acidiphilus 0247T e A. cycloheptanicus 0297T foi de 250 μg/mL. Para a cepa A. acidocaldarius 0299T, o CBM foi de 500 μg/mL. Segundo Holetz et al., (2002), que avaliam a atividade antimicrobiana em várias plantas contra muitas bactérias, é possível considerar que uma CIM abaixo de 100 μg/ml apresenta grande atividade antimicrobiana de 100 a 500 μg/mL atividade antimicrobiana moderada, de 500 a 1000 μg/ml, a atividade é classificada como fraca e acima de 1000 μg/ml é considerada inativa. Portanto, podemos considerar que o látex apresentou grande atividade antimicrobiana contra as espécies de Alicyclobacillus estudadas em nossa pesquisa. Boligon et al., (2015) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato bruto da casca de T. catharinensis (A. DC.) contra bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas e fungos, encontrando valores de CIM > 1000 μg/mL. Estudos realizados por Gindri et al., 2011 com a fração n-butanol de folhas de T. catharinensis (A. DC.) Mostraram efeitos antibacterianos contra Micrococcus sp. (CIM 31,25 mg/mL), Aeromonas sp. (CIM 250 mg/mL), Proteus mirabilis e Enterococcus faecalis (CIM 62,50 mg/mL). Citotoxicidade: O efeito citotóxico do látex bruto de T. catharinensis (A. DC.) Foi avaliado pelo número de células sobreviventes considerando que as células mortas não podem metabolizar o MTT. Os valores de CC50 encontrados para o látex bruto foram de 84,67 ± 8,14 μg/ml. O índice de seletividade foi 10,84. Uma pesquisa feita por Boligon et al. (2015) que avaliaram T. catharinensis (A.DC) e a atividade citotóxica da casca da casca apresentou resultados de CC50 = 59,53 ± 4,56 μg/mL, o que nos permite perceber que o látex bruto apresenta maior valor para CC50, que admite usar 9 vezes a CIM e manter dentro dos limites de citotoxicidade, de acordo com valores determinados em nossas análises. Microscopia eletrônica de varredura: Foram observadas alterações morfológicas em células vegetativas de A. acidoterrestris tratadas com T. catharinensis (A. DC.) em suco de laranja concentrado, quando comparadas com a amostra não tratada. Molva & Baysal (2015), em um estudo com suco de romã e sementes de uva com suco de maçã e A.
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acidoterrestris DSM 3922, relataram alterações morfológicas na estrutura e nos esporos das células bacterianas, semelhantes aos nossos resultados.
CONCLUSÕES: O extrato de látex de T. catharinensis (A. DC.) foi efetivo contra células vegetativas de Alicyclocacillus spp. e baixas concentrações são capazes de inibir o crescimento bacteriano de cinco espécies de Alicyclobacillus spp. Através da aplicação do látex bruto no suco de laranja reconstituído e da análise por microscopia eletrônica de varredura, foi possível encontrar importantes alterações morfológicas, como ruptura celular e deformações na parede celular de A. acidoterrestris. O índice de seletividade permitiu confirmar a alta razão entre toxicidade e atividade. O teste de citotoxicidade em látex bruto mostrou resultados que permitem o uso de até nove vezes a CIM e, ainda que estudos adicionais de toxicidade in vivo são necessários para a aplicação deste composto em alimentos. A aplicação do látex bruto de T. catharinensis (A. DC.) em suco de laranja reconstituído como conservante contra Alicyclobacillus spp. surge como uma possibilidade para o futuro e requer estudos complementares, uma vez que este estudo é inédito, utilizando esta planta com essas espécies de microorganismos.