OLIVEIRA, Thamiris Fernandes de. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Fevereiro de 2018. Influência da atividade da GalLDH na via de biossíntese do ácido ascórbico, na produção de H2O2 e nos danos oxidativos em mamão ‘Golden’. Orientador: Prof. Jurandi Gonçalves de Oliveira.
O ácido ascórbico (AA) é um importante antioxidante presente nos vegetais. As espécies reativas de oxigênio (ERO) são inevitavelmente formadas pelo metabolismo aeróbico. Entretanto, quando há o acúmulo de ERO e os mecanismos de defesa antioxidantes não funcionam adequadamente ocorre o estresse oxidativo, resultando em diminuição da função mitocondrial e oxidação de lipídios, proteínas e até mesmo ácidos nucleicos. Há evidências de que durante a biossíntese do AA a enzima L-galactono-1,4-lactona desidrogenase (GalLDH, EC 1.3.2.3) localizada em mitocôndrias de células vegetais, estaria produzindo peróxido de hidrogênio (H2O2). Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi compreender o papel da GalLDH na produção de H2O2 e no dano oxidativo em frutos de mamão ‘Golden’. Os frutos foram padronizados pela coloração da casca a partir do ângulo hue e pela firmeza da polpa. Foi determinada a influência da atividade da GalLDH nas vias oxidases terminais durante a respiração, no acúmulo de AA e sua interação com a via oxidase alternativa (AOX) e com a produção de H2O2 em mitocôndrias purificadas da polpa dos frutos. Também foi determinada a influência da biossíntese do AA na oxidação de proteínas mitocondriais, na atividade da peroxidase (POD) e na peroxidação lipídica (medida pela formação de MDA) em extrato de polpa de mamão. Os resultados mostraram que na presença de GalL como substrato respiratório, ao adicionar o ácido salicilhidroxâmico (SHAM) e azida, respectivamente, inibidores da AOX e do citocromo c oxidase (COX), não foi observada diferença no consumo de O2. Por outro lado, ao adicionar cloreto de difenileno iodônio (DPI), um bloqueador de flavoenzimas, foi observado um decréscimo significativo na taxa respiratória das mitocôndrias isoladas. O acúmulo de AA foi maior em mitocôndrias tratadas com GalL e menor na presença de H2O2, assim como dos inibidores DPI e SHAM, com destaque para a redução mais expressiva ao utilizar SHAM. A atividade da GalLDH foi quantificada por meio da redução do citocromo c, sendo verificado na presença de GalL um estímulo em 100% na atividade da enzima, enquanto que na presença de SHAM houve redução de 97% na atividade GalLDH. A produção de H2O2 foi analisada via fluorescência em mitocôndrias tratadas e não tratadas com GalL, sendo observado um aumento progressivo da produção de H2O2 em função do substrato GalL. A adição de GalL foi responsável pelo aumento na atividade da peroxidase (POD) e na peroxidação lipídica que foi avaliada a partir da produção de malondialdeído (MDA). Verificou-se também que a adição de GalL aumentou a quantidade de proteínas mitocondriais oxidadas, enquanto que a adição de GalL combinada com SHAM reduziu essa quantidade. De modo geral os resultados demonstraram que durante a biossíntese de AA, a atividade GalLDH é dependente da atividade AOX. Paralelamente à produção de AA, a atividade GalLDH está relacionada ao incremento na produção de ERO com aumento na peroxidação lipídica e oxidação de proteínas. O bloqueio da via AOX resultou em redução na quantidade de proteínas oxidadas indicando uma estreita ligação entre a atividade AOX, a GalLDH e a produção de H2O2. Este trabalho apresenta resultados inéditos em relação à atividade da GalLDH influenciando no transporte de elétrons e na produção de H2O2, que resultou em estresse oxidativo afetando o metabolismo mitocondrial. Outros estudos devem ser feitos para verificar o efeito da oxidação das proteínas assim como a caracterização funcional dessas.