O cenário atual de constante crescimento da demanda por combustíveis traz a necessidade de se buscar por novas fontes alternativas de energia e ambientalmente mais corretas. O etanol de segunda geração, proveniente da
fermentação de açúcares da biomassa vegetal, como o bagaço da cana-deaçúcar, aparece como uma alternativa sustentável para substituir, em parte, os combustíveis fósseis, mas depende da resolução de alguns entraves
biotecnológicos, como o transporte e metabolização de xilose pela Saccharomyces cerevisiae. Frente a isso, este projeto teve por objetivo melhorar a eficiência de dois transportadores, o HxtB de Aspergillus niger e Gxf1 da Candida intermedia através da introdução de mutações aleatórias via PCR error prone (técnica de PCR com mutações induzidas). Como resultado, foram gerados 119 clones para o transportador Gxf1 mutado e 87 para o transportador HxtB, na cepa S. cerevisiae EBY VW.4000 que possui todos seus transportadores deletados, exceto os para maltose. Estes clones foram avaliados quanto à eficiência do transporte de xilose em diferentes concentrações deste açúcar por ensaios de drop out e, os que apresentaram melhores resultados de crescimento em relação aos controles (cepas contendo os transportadores sem mutação), foram posteriormente avaliados pela construção de curvas de crescimento em meio líquido. Para os clones com fenótipos melhorados para o transporte de xilose, observou-se que a maioria
das mutações inseridas estão em domínios relacionados ao transporte de açúcar, entretanto, estudos estruturais mais aprofundados devem ser realizados para se elucidar a real influência de cada mutação. Além disso, este
projeto objetivou a melhoria do consumo de xilose em cepas de S. cerevisiae PE-2 JAY291 haploides contendo os transportadores HxtB, Gxf1 e o plasmídeo pRH274 (para metabolização da xilose) por meio da mutagenização com
etilmetanosulfonato e evolução dirigida. A evolução foi feita através de repiques sucessivos em meios de cultura contendo xilose em semi-anaerobiose e anaerobiose, com avaliação do crescimento de 23 clones mutados. Nesta
etapa, quatro clones se destacaram no experimento, cada qual em uma condição de evolução específica, mostrando que as mutações inseridas no genoma dos mesmos conferiu características distintas pra cada um. Embora vários grupos de pesquisa no Brasil, e principalmente no exterior, vêm trabalhando nesta temática, ainda não foi obtido um microrganismo totalmente adaptado às condições brasileiras para produção de etanol 2G a partir da fermentação da xilose de forma economicamente viável. Estes transportadores, bem como a posterior identificação e validação das modificações genéticas das cepas evoluídas, contribuirão para o futuro engenheiramento genético racional
de linhagens de leveduras industriais.