Biotecnologias reprodutivas como a produção in vitro de embriões e a transferência de núcleo
apresentam grande potencial de aplicação na medicina veterinária seja para a correção de
infertilidades, para o aumento na eficiência da produção animal ou mesmo para um melhor
entendimento sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial.
Porém, manipulações in vitro de gametas ou embriões levam a alterações na regulação
epigenética, podendo causar altas taxas de anormalidades no desenvolvimento e no
nascimento de indivíduos derivados. A geração de um modelo de indução da pluripotência in
vitro, ou seja, a geração de células iPS (do inglês induced pluripotent stem cells) possibilitou
estudar o processo de reprogramação in vitro de maneira robusta e precisa. Os genes OCT4 e
SOX2 são fundamentais no processo de aquisição e manutenção da pluripotência celular, e
recentemente foi reportado que a ação destes dois fatores exerce grande influência sobre a
regulação de alguns genes imprinted, em especial, no locus H19/IGF2, sabidamente
importantes para o desenvolvimento normal do embrião e de sua placenta. Este estudo propõe
a geração de um modelo experimental in vitro onde os fatores em questão sejam estudados,
juntos ou em combinação, quanto à sua influência na regulação do imprinting genômico. Para
tal, três linhagens de fibroblastos fetais bovinos (bFF1, bFF2 e bFF3) foram transduzidas com
vetores lentivirais contendo cDNAs de OCT4 ou SOX2 humanos. Os fibroblastos foram
analisados através de citometria e as células positivas foram separadas e recuperadas (sorted).
Os fibroblastos expressando OCT4, SOX2, ambos (OCT4 + SOX2), nenhum (controle)
juntamente com um controle recuperado (não sorted) não transgênico (total de cinco
tratamentos) foram investigados quanto à expressão de genes relacionados à pluripotência e
expressão de genes imprinted, bem como a manutenção dos padrões de metilação do DNA no
locus H19/IGF2. Além disso, estas células foram submetidas à reprogramação in vitro e
produção de células iPS. A indução à pluripotência foi realizada através da transdução dos
fibroblastos com o vetor policistrônico contendo o cDNAs murino ou humano dos fatores de
transcrição OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4 (OSMK, vetor STEMCCA). Os resultados da
análise de fluorescência por citometria de fluxo foram, em média, de 40,4% para OCT4, 6,1%
para SOX2 e 0,63% para OCT4 + SOX2. A bFF1 foi a única linhagem a apresentar uma
recuperação pós-sorting, o que possibilitou sua utilização para a indução da pluripotência. De
maneira interessante, as células que não passaram pela citometria geraram colónias de células
iPS, enquanto que os demais grupos não. A quantificação de transcritos por qRT-PCR
mostrou que a expressão de OCT4 e de SOX2 estava aumentada nos respectivos grupos, a
expressão do gene H19 mostrou-se aumentada no grupo controle que passou pelo
procedimento de sorting e a expressão do gene imprinted IGF2R não variou entre os grupos.
Já a análise preliminar da manutenção do padrão de metilação de DNA na DMR do locus
H19/IGF2 mostrou que o grupo controle sorted apresentou uma leve diferença no padrão de
metilação quando comparada aos outros grupos. Neste estudo, portanto, o procedimento de
separação e recuperação celular por citometria de fluxo celular, aliado ao elevado número de
repiques celulares durante o cultivo prolongado pode ter levado a um efeito prejudicial sobre
a eficiência de reprogramação in vitro.