A tripanosomíase é causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma vivax e acomete ungulados domésticos e selvagens. Estima-se que animais infectados contribuam com uma perda anual de 160 milhões de dólares, devido a redução na produção de leite e carne, perda de escore corporal, dificuldades na reprodução, abortos e em muitos casos, morte. O patógeno causa sintomatologia clínica que pode ser similar a outras patologias que acometem bovinos, portanto o diagnóstico deve ser preciso e não erroneamente diagnosticado como uma doença com sintomatologia similar. O objetivo do presente trabalho foi obter proteína recombinante do Trypanosoma vivax e padronizar um teste ELISA (Enzime linked immunosorbent assay), para diagnóstico da tripanosomíase bovina com maior sensibilidade e especificidade. Uma proteína foi selecionada por meio de análise por bioinformática, produzida de forma recombinante, expressa, purificada e utilizada na padronização do ELISA. Inicialmente, diferentes concentrações de proteína recombinante (1, 10, 100 e 1000 nanogramas) foram testadas, bem como diferentes diluições de pool de soros positivos de animais experimentalmente infectados e negativos (1:100, 1:250 e 1:500) e diferentes diluições de conjugado anti-IgG marcado com peroxidase (1:5000, 1:10000 e 1:20000). Após a padronização, foi realizado o teste utilizando-se amostras de bovinos infectados experimentalmente por T. vivax nos dias 0, 21, 24, 27 e 30 pós-infecção experimental. A maior diferença de densidade ótica entre animais positivos e negativos foi observada utilizando-se 1000 nanogramas de proteína recombinante, soro na diluição de 1:100 e conjugado na diluição de 1:5000. Após analisar as densidades óticas, foi realizada a curva ROC (Receiver Operating Characteristic) e estabelecido um ponto de corte de 0,04. O teste apresentou acurácia de 98,6%, sensibilidade de 94,4% e especificidade de 100%. Valor preditivo positivo e valor preditivo negativo foram 100% e 93,3%, respectivamente. A razão de verossimilhança negativa e positiva foram de 0,06 e +∞, respectivamente. A padronização se mostrou adequada com a quantidade utilizada de proteína recombinante de 1000 nanogramas, diluição de soros de 1:100 e diluição de conjugado de 1:5000. Sensibilidade e especificidade obtidos com soro de animais infectados experimentalmente são promissores e destacam o potencial da proteína recombinante para diagnóstico preciso da tripanosomíase bovina.