O transplante de células germinativas primordiais (CGPs) é uma abordagem
promissora para área da Aquicultura, mas para isso é necessária à compreensão dos
estágios de desenvolvimento embrionário e larval como também a padronização de
técnicas relacionadas à micromanipulação do embrião e de células germinativas a fim de
obter com sucesso quimeras germinativas. Assim, os objetivos desta pesquisa foram
avaliar o efeito de três temperaturas (22oC, 26oC e 30oC) sob o desenvolvimento inicial de
B. amazonicus (espécie doadora); desenvolver protocolos para micromanipulação de ovos,
de células embrionárias e de criopreservação de blastômeros em Astyanax altiparanae
(espécie receptora); identificar as CGPs e a rota de migração dessas células em ambas as
espécies, além da produção de quimeras germinativas através do transplante de células
embrionárias a fim de que a espécie receptora estéril (3n) produza gametas da espécie
doadora. Para isso, os reprodutores das espécies envolvidas foram induzidos
hormonalmente à reprodução, os gametas foram extrusados e fertilizados pelo método a
seco. Para avaliar o desenvolvimento inicial, ovos recém-fertilizados foram distribuídos em
aquários com oxigenação e temperatura controlada, coletados em momentos pré-
estabelecidos e analisados sob estereomicroscópio. Para o desenvolvimento do protocolo
de micromanipulação de ovos de Astyanax altiparanae, inicialmente avaliou-se a eficácia
na remoção do córion em alíquotas de ovos recém-fertilizados distribuídas em placas de
Petri contendo pronase (0,05%) ou tripsina (0,15%) diluídas em solução salina (Holtfreter;
Characin; Ringer; Hanks; D-PBS ou MEM) e foi observada a solução enzimática mais
eficiente sem afetar a viabilidade do embrião. Posteriormente, os ovos foram submersos
nas mesmas soluções salinas testadas para remoção do córion, livres de enzimas. Para
determinar a melhor solução salina de incubação foi observada a morfologia desses ovos.
Ovos decorionados de A. altiparanae foram microinjetados com isotiocianato de
fluoresceína (FITC-coloração verde) durante as primeiras clivagens e na fase de blástula,
os blastômeros foram dissociados e imersos em soluções crioprotetoras com diferentes
osmolaridade e concentrações para vitrificação. Após o descongelamento, a viabilidade foi
analisada com auxilio de iodeto de propídio (cora em vermelho as células mortas). Para
visualização e rastreabilidade das CGPs endógenas, ovos decorionados de A. altiparanae e
B. amazonicus foram microinjetados com GFP-nos1 3‟UTR mRNA no estágio de 1-2
células e mantidos em solução de Holtfreter e Characin, respectivamente e observados em
cada estágio do desenvolvimento. Para o transplante, ovos da espécie doadora foram
microinjetados com FITC no blastodisco para marcação celular, os ovos da espécie
receptora foram submetidos a choque térmico para triploidização (3n). Quando as duas
espécies atingiram o estágio de blástula, os blastômeros corados (doador) foram
transplantados na blastoderme de embriões receptores não corados. A taxa de peixes
quiméricos e a migração dos blastômeros do doador no embrião receptor foram
mensuradas. Os resultados mostraram que a duração dos estágios de desenvolvimento foi
maior em 22oC e menor em 30oC, e a fase de 512-1000 blastômeros, no estágio de blástula,
fase de interesse para o transplante celular, foi de 1 h 30 min a 22oC e limitada a 25 min
nas demais temperaturas, afetando também o tempo de eclosão. A solução mais eficiente
para remoção do córion em A. altiparanae foi de Characin com pronase (1:44 min) e para
incubação dos ovos foi a solução de Holtfreter por apresentar blastômeros com tamanhos
semelhantes, formando uma massa uniforme similar aos do controle. Após a
criopreservação, 10% de blastômeros viáveis foram obtidos em quatro soluções
crioprotetoras (DMSO, EG e sacarose) com osmolaridade de 1,5; 4,5; 6,5 e 7,5. As CGPs GFP-positivas foram visualizadas em ambas as espécies no estágio de somitogênese,
localizadas na região medial do embrião, as quais migraram durante o desenvolvimento
inicial. Com o transplante de blastômeros obteve-se uma quimera germinativa, a qual
apresentou células fluorescentes na região das cristas gonadais, sendo observadas,
inicialmente em estágio de final segmentação. Estes resultados proporcionam
conhecimentos para a manipulação de embriões sob diferentes temperaturas, o que permite
acelerar ou retardar estágios específicos do desenvolvimento embrionário otimizando o
tempo de micromanipulação de embriões para aplicações em estudos biotecnológicos;
fornece informações sobre as condições necessárias para o preparo e a manutenção de
embriões e blastômeros para o transplante de células embrionárias e ainda, proporciona
conhecimento sobre a morfologia e a rota de migração de CGPs endógenas de A.
altiparanae e B. amazonicus o que possibilitou a produção de quimeras interespecíficas.