O plantio direto (PD) potencializa o acúmulo de carbono (C) e nitrogênio (N) no solo e pode mitigar a emissão de gases de efeito estufa (GEE) em relação ao preparo convencional (PC). O objetivo do estudo foi avaliar a influência de sistemas conservacionistas de preparo do solo e níveis de adubação no sequestro de C e acúmulo de N em Latossolo, e na mitigação de GEE pela determinação do PAG, num experimento implantado em 1989. Para sequestro de C e acúmulo de N foram selecionados quatro sistemas de preparo do solo: plantio direto (PD), plantio direto com escarificação trianual (PDE), preparo mínimo com gradagens (PM), e preparo convencional com aração e gradagem (PC), sendo esses sistemas combinados com dois níveis de adubação: normal, com fertilização recomendada desde 1989, e reduzida, supressão total de fósforo (P) e potássio (K), mas com a mesma adubação nitrogenada em cobertura que a normal, desde 1993. A coleta de solo em 0-100 cm de profundidade ocorreu em maio de 2013, quando o experimento completou 24 anos. Para determinação do PAG foram selecionados os sistemas PD, PDE e PC em adubação normal. Amostras de ar foram coletadas num período de monitoramento de 835 dias, incluindo duas safras de verão e três safras de inverno. O sistema de culturas do experimento engloba soja (Glycine max (L.) Merr.) e milho (Zea mays L.), no verão; trigo (Triticum aestivum L.), aveia preta (Avena strigosa Schreb.), essa para cobertura, e branca (Avena sativa L.), para grãos, no inverno. O delineamento experimental foi blocos ao acaso em três repetições e tratamentos dispostos em faixas. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,10). O solo em PD sequestrou 0,60 Mg COT ha-1ano-1, até 30 cm na adubação normal, e 0,76 Mg COT ha-1ano-1, até 100 cm na adubação reduzida em relação ao solo em PC, e o acúmulo de NT foi 34,6 e 27,5 kg ha-1ano-1, até 10 cm nas adubações normal e reduzida, respectivamente. O comportamento do solo em PDE foi similar ao do PD, a taxa de sequestro foi 0,61 Mg COT ha-1ano-1, até 45 cm na adubação normal, e 0,77 Mg COT ha-1ano-1, até 100 cm na adubação reduzida, e o acúmulo de NT foi 20,0 e 18,8 kg NT ha-1ano-1, até 10 cm nas adubações normal e reduzida, respectivamente. O solo em PM praticamente não acumulou COT nem NT em relação ao solo em PC. A adubação normal aumentou as taxas de sequestro de COT até 10 cm no solo em PD (0,27 Mg ha-1ano-1), e PDE (0,13 Mg COT ha-1ano-1) e em PC (0,15 Mg COT ha-1ano-1). No solo em PM (0,08 Mg ha-1ano-1) houve efeito de adubação apenas na camada de 10-20 cm. Por efeito de adubação, houve maior acúmulo de NT no solo em PD (14,5 kg ha-1ano-1) até 10 cm, no solo em PDE (5,0 kg ha-1ano-1) na camada de 5-10 cm, e no solo em PM (5,0 kg ha-1ano-1) e PC (4,0 kg ha-1ano-1), exclusivamente até 5 cm. A emissão acumulada média anual de N2O no período avaliado, em kg de N-N2O ha-1, foi maior no solo em PC (9,2), e menor no solo em PD (6,2) e PDE (6,7). Elevados fluxos de N2O ocorreram após preparo do solo (convencional ou escarificação), semeadura e adubação nitrogenada na semeadura; após adubação nitrogenada em cobertura, principalmente; e na senescência da soja. O consumo acumulado médio anual de CH4, em kg de C-CH4 ha-1, foi maior no solo em PD (7,0) e PDE (5,9), possivelmente pela melhor condição estrutural do solo que estimulou a metanotrofia, e menor no solo em PC (3,7). Efluxos de CH4 ocorreram após adubações nitrogenadas, principalmente, e preparos de solo. Com relação ao PAG, todos os sistemas agiram como fonte de GEE, em C-CO2-eq ha-1, mas PD, com 571,4 kg C-CO2-eq ha-1 ano-1 apresentou o menor PAG e PDE, com 662,2 kg C-CO2-eq ha-1 ano-1, um PAG próximo ao PD enquanto o maior PAG foi obtido no PC (1648,1 kg C-CO2-eq ha-1 ano-1). O maior PAG obtido no PC deve-se a maior emissão de N2O e elevados custos operacionais, enquanto o menor PAG no PD e PDE foi pelo sequestro de C e menor emissão de N2O. Conclui-se que sistemas conservacionistas de preparo, como plantio direto ou plantio direto escarificado, acumulam COT e NT, favorecendo o estoque de matéria orgânica no solo (MOS). Resultados indicam que PD e PDE atuam como fonte de GEE não representando uma real contribuição na mitigação do aquecimento global, entretanto são estratégias eficientes para reduzir emissões de GEE em relação ao PC.