Introdução e objetivos: beta-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril (beta/alfa)8. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um “meio barril” (beta/alfa)4. Assim, as proteínas com dobramento barril (beta/alfa)8 seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral “meio barril” (/)4. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios (/)4, as metades N- e C-terminal, na estrutura (beta/alfa)8 barril da beta-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e beta-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) através da análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem ligações não covalentes entre os supostos domínios destas beta-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em E. coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm (chamadas de T1 e T2). Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos para hidrólise de diferentes substratos sintéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividade catalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando kobs de 0,3 min-1 em 80°C e de 0,06 min-1 em 75 °C.. O cálculo de Tm através de DSF foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios ()4. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o c50 diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (deltaGH2O = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (deltaGH2O = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios (beta/alfa)4. Em conclusão, a análise estabilidade da -glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios (beta/alfa)4 que correspondem às metades N- e C-terminal desta -glicosidase.