As fluorquinolonas de quarta geração, representadas pelo gatifloxacino (GA), moxifloxacino (MO) e besifloxacino (BE), são uma das classes de medicamentos oftálmicos mais utilizados. Desta forma, o presente estudo teve por objetivo validar uma nova técnica analítica para quantificação simultânea de GA, MO e BE com o uso da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) na córnea e humor aquoso (HA), e identificar e quantificar estes fármacos nos tempos de 10 minutos e uma hora após a instilação de uma gota nos olhos de cães. Foram utilizados 22 cães machos, com idade aproximada entre um e sete anos, destinados à eutanásia por serem portadores de Leishmaniose Visceral Canina (LVC), sem lesões observadas ao exame oftalmológico. Inicialmente, foi feita avaliação por meio da histologia para verificar se os bulbos oculares (BO) dos cães utilizados apresentavam lesões microscópicas. Dentre os 22 cães selecionados, constatou-se que em apenas 15,9% dos BO apresentavam lesões inflamatórias e dois animais apresentavam degeneração retiniana, alteração relacionada com a idade avançada do animal, sendo retirados do estudo. A validação da técnica analítica foi determinada por meio de etapas que determinaram a seletividade, sensibilidade e reprodutibilidade do método, sendo ele eficaz para a quantificação simultânea destes fármacos. Em relação à concentração, na córnea no tempo de 10 minutos, foram obtidos, na média, os seguintes resultados: MO (18,6 μg/g) seguida do BE (6,01 μg/g) e do GA (4,35 μg/g). No tempo de uma hora a ordem dos fármacos se manteve, sendo: MO (11,7 μg/g), BE (5,51 μg/g) e GA (2,36 μg/g). No HA no tempo de 10 minutos foram obtidos os seguintes resultados: BE (1,70 μg/mL), seguida do MO (1,62 μg/mL) e GA (0,06 μg/mL). No tempo de uma hora a ordem dos fármacos se manteve, sendo o BE (1,71 μg/mL), o MO (1,68 μg/mL) e o GA (0,10 μg/mL). Assim, foi verificado que, nos dois tempos de mensuração analisados, o MO foi o fármaco que obteve maior concentração na córnea, enquanto que no HA foi o BE.