INTRODUÇÃO. Alicyclobacillus acidoterrestris foi isolado primeiramente em 1980 do suco de maçã. Seu nome foi associado aos ácidos graxos cíclicos constituintes de sua membrana celular, característica que tornam seus esporos mais resistentes ao tratamento térmico, este fator pode estar relacionado a redução da permeabilidade da membrana. A. acidoterrestris é um bacilo Gram-positivo, ácido-termofílico, aeróbico, catalase positiva, formador de esporos terminal ou subterminal, deteriorante de alimentos e não patogênico. Possui bom desenvolvimento em ambientes acidificados (com pH entre 2,5 a 6,0) e altas temperatura (entre 20 a 60 ºC). Uma das características importante do A. acidoterrestris é deteriorar sucos de frutas ácidas, como o de laranja. A deterioração por A. acidoterrestris ocorre devido a produção de 2-metoxifenol (guaiacol), 2,6-dibromofenol e 2,6 diclorofenol, substâncias associadas ao sabor e odor desagradáveis presentes em alimentos contaminados. Sua deterioração é caracterizada pela falta de produção de gases, baixa turbidez e sedimentação, sendo assim difícil de ser detectada. O processo de pasteurização contribui com a redução de micro-organismos patogênicos e deteriorantes, auxiliando na segurança alimentar e favorecendo uma redução na aplicação de conservantes químicos. No entanto, os micro-organismos esporulados conseguem resistir às temperaturas mais elevadas aplicadas neste processo, e em condições adequadas se desenvolvem dentro dos produtos já embalados, diminuindo a vida de prateleira, causando perdas e prejuízos econômicos. O Brasil é um grande exportador de suco de laranja, responsável por 50% da produção. Para garantir a qualidade do suco de laranja, há uma grande necessidade de pesquisas que favoreçam o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos que possam contribuir com a preservação do alimento, aumentando sua vida de prateleira, garantindo a conservação de suas características sensoriais e nutricionais tornando-os mais saudáveis para o consumo. A procura de agentes antimicrobianos naturais aumentou por causa da popularidade do consumismo verde e preocupações relacionadas por parte dos consumidores e agências reguladoras para a saúde e segurança dos produtos alimentares. Muitos trabalhos mostram a eficiência dos óleos essenciais (OEs) e seus isolados, assim como o emprego da nisina, com grande potencialidade como agente antibacteriano, aplicados sozinhos ou em ação conjunta, exercendo efeitos bacteriostático, bactericida e/ou esporicida.
OBJETIVOS. Diante do exposto, este trabalho teve como principal objetivo avaliar a atividade antibacteriana dos óleos essenciais de Copaifera multijuga e Thymus vulgaris frente às formas vegetativa e esporulada de Alicyclobacillus acidoterrestris, assim como verificar sua ação combinada à nisina.
MATERIAL E MÉTODOS. Cepa bacteriana e condições de cultura: A linhagen-tipo utilizada nos ensaios foram A. acidoterrestris (CBMAI 0244T – origem: Solo). O meio de cultura utilizado foi o BAT (Bacillus acidoterrestris) com pH final ajustado em 4,0. Preparação dos inóculos: A suspensão da célula vegetativa de A. acidoterrestris foi preparada conforme preconiza o CLSI M7-A9. Os esporos de A. acidoterrestris, foram preparados e armazenados em água deionizada estéril em ambiente refrigerado a 4 ºC até sua utilização. Óleos essenciais: O óleo essencial (OE) de T. vulguris (tomilho) foi obtido do Laboratório de Toxicologia da Universidade Estadual de Maringá – Paraná – Brasil. O OE de C. multijuga (Amazonas) foi obtido do Laboratório de Microbiologia Aplicada aos Produtos Naturais e Sintéticos Ciências Básicas da Saúde da Universidade Estadual de Maringá – Paraná – Brasil. Nisina: A solução estoque de nisina purificada adquirida comercialmente, foi preparada em ácido clorídrico (HCl) na concentração de 0,02 M e esterilizada em membrana de 0.22 μm. Determinação da atividade antibacteriana dos óleos essenciais: A atividade antibacteriana dos OEs foram determinadas por meio de microdiluições seriadas conforme preconiza a CLSI M7-A9. Foi possível avaliar a Concentração Inibitória Mínima (CIM), a Concentração Bactericida Mínima (CBM) e a Concentração Esporicida Mínima (CEM). Método checkerboard: Este método é muito utilizado em avaliações in vitro da combinação de duas drogas como agente antibacteriano. As microdiluições foram realizadas conforme Schelz, Molnar e Hohmann (2006). A interpretação dos resultados foi realizada conforme Gutierrez, Barry-Ryan e Bourke (2008). Curva de tempo de morte: Este ensaio foi realizado conforme Ruiz et al. (2013) e mostra o tempo de declínio da bactéria em contato com os agentes antimicrobianos. Efeito dose resposta: A determinação da concentração inibitória de 50% (IC50) das células vegetativa de A. acidoterrestris foi realizada por meio de microdiluições seriadas conforme Tanaka et al. (2006). Ensaio da viabilidade celular: A atividade citotóxica dos OEs foram avaliados pelo método colorimétrico MTT conforme descrito por Mosmann (1983). A citotoxicidade perante às células VERO foi comparada ao Índice de seletividade (SI) determinada pela razão entre a concentração citotóxica de 50% (CC50) para as células VERO e a concentração inibitória de 50% (IC50) das bactérias. Microscopia eletrônica de varredura: Neste ensaio foi possível verificar as alterações morfológicas das células vegetativas e dos esporos de A. acidoterrestris por meio da comparação com o controle negativo (sem tratamento). Esta metodologia foi realizada conforme Haddad et al. (2007). Citometria de fluxo: Neste ensaio foi determinada as taxas de sobrevivência e integridade da membrana celular conforme Anjos et al. (2013).
RESULTADOS E DISCUSSÃO. Determinação da atividade antibacteriana dos óleos essenciais: A CIM e a CBM dos OEs de C. multijuga e T. vulgaris foram determinadas frente às formas vegetativas e esporuladas de A. acidoterrestris. Para ambos os tratamentos, os melhores resultados foram obtidos frente às formas vegetativas com atividade antibacteriana moderada (valores entre 100 a 500 μg mL-1). Os EOs apresentaram uma atividade antibacteriana fraca contra os esporos de A. acidoterrestris (valores entre 500 a 1000 μg mL-1). A resistência dos esporos ao tratamento com os OEs, podem estar relacionada a presença do ácido dipicolínico encontrados nos endoesporos, essa característica lhes confere alta resistência a tratamentos térmicos e químicos (Paredes-Sabja, Setlow e Sarker, 2011). A CIM e a CBM do OE de C. multijuga frente às formas vegetativas de A. acidoterrestris foram de 300 μg mL-1 e >1.000 μg mL-1, respectivamente. Para os esporos houve uma redução de 3,07 Log UFC mL-1 quando tratados em concentrações de 500 μg mL-1. A CIM e a CBM para o óleos essencial de T. vulgaris frente as formas vegetativas de A. acidoterrestris foi determinada em 500 μg mL-1 e >1.000 mL-1 respectivamente. Para tratamentos utilizando os esporos foram observadas reduções de 0,64 Log UFC mL-1 e 2,05 Log UFC mL-1, quando tratados em concentrações de 500 μg mL-1 e 1.000 μg mL-1, respectivamente. A nisina exibiu boa atividade bacteriostática, bactericida e esporicida frente à A. acidoterrestris. O CIM e a CBM para as formas vegetativa foram de 15,60 μg mL-1 e 31,25 μg mL-1 respectivamente. A CEM foi alcançada na concentração de 62,50 μg mL-1 com eliminação completa dos esporos. Os resultados presente em nossos ensaios foram semelhantes aos encontrados por Ruiz et al. (2013). Método checkerboard: A avaliação dos OEs (C. multijuga e T. vulgaris) em combinação com a nisina foram realizados por meio da microdiluição pelo método checkerboard. Para ambos os tratamentos o índice FIC obtido foi de 0,75, no qual produziu um efeito aditivo. A nisina e os OEs possuem grande potencialidade como agentes antibacterianos de origem naturais, e seus efeitos combinados são alternativas promissoras frente a diversos micro-organismos e com aplicações em matrizes alimentares, podendo ser utilizados como conservantes de alimentos. Curva de tempo de morte: A curva de morte foi realizada para investigar a atividade antibacteriana dos OEs. Na concentração de 8x a CIM do OE de C. multijuga houve redução completa da carga bacteriana de A. acidoterrestris nas três primeiras horas de tratamento. Em valores de 4x e 2x a CIM houve a necessidade de um tratamento mais prolongado, com duração de 48 h para eliminar as formas vegetativas de A. acidoterrestris. Tratamento empregando 1x a CIM após 24 h foi possível reduzir aproximadamente 4,65 Log UFC mL-1. Para o tratamento utililizando o OE de T. vulgaris houve uma menor redução quando comparado ao tratamento utilizando o OE de C. multijuga. A redução bacteriana completa foi obtida após 48 h de tratamento na concentração de 8x o CIM. No tratamento empregando a concentração de 1x o CIM após 24 h houve uma redução de 3,81 Log UFC mL-1 e após 48 h a redução foi de aproximadamente 4,11 Log UFC mL-1. Efeito dose resposta e viabilidade celular: Os resultados obtidos neste ensaio revelaram que os OEs de C. multijuga e T. vulgaris apresentaram valores de CC50 de 54,20 μg mL-1 e 142,3 μg mL-1 respectivamente, provocando uma redução de 50% das células VERO viáveis nestas concentrações. O resultado do IC50 para A. acidoterrestris utilizando os tratamentos com os OEs de C. multijuga e T. vulgaris foi de 500 μg mL-1 e 1.000 μg mL-1, respectivamente, sendo que nestas concentrações houve uma inibição do crescimento bacteriano em 50%. Quando comparado o CC50 e o IC50 os resultados foram menos seletivos para A. acidoterrestris e mais tóxicos para as células VERO. O índice de seletividade (IS) para o OE de C. multijuga foi de 0,11 e para T. vulgaris foi de 0,14, respectivamente. Microscopia eletrônica de varredura: Neste ensaio foi possível observar alterações morfológicas externas em ambos tratamentos e formas celulares quando comparadas ao controle. Citometria de fluxo: Neste ensaio foi possível observar que as células vegetativas de A. acidoterrestris tratadas com os OEs de C. multijuga e T. vulgaris em suas respectivas CIMs tiveram uma porcentagem maior de células com alterações na integridade da membrana celular quando comparadas ao controle negativo. Enquanto que os esporos tratados com os OEs de C. multijuga e T. vulgaris nas concentrações de 500 μg mL-1 e 1.000 mL-1, respectivamente, não apresentaram alterações quando comparados ao controle negativo. No entanto, não podemos concluir que o principal mecanismo de ação dos OEs seja alterações na membrana celular, pois a porcentagem de células com alterações na membrana foram baixas em todos os tratamentos, onde a variação foi de 29,94% a 4,24%.
CONCLUSÕES. Nossos estudos mostraram que as substâncias testadas apresentaram boas propriedades antibacterianas porque reduziram a viabilidade de A. acidoterrestris. Desta maneira, fica evidente que os CEs da C. multijuga e T. vulgaris têm potencial para utilização como agentes antibacterianos frente A. acidoterrestris.