Resumo:
As bactérias propiônicas lácteas, principalmente a espécie P. freudenreichii,
apresentam um papel importante na tecnologia de produção de queijos do tipo
suíço, uma vez que os produtos do seu metabolismo contribuem para o
desenvolvimento de flavor e olhaduras nos queijos. Os objetivos deste estudo
foram I) avaliar um método alternativo de enumeração de bactérias
propiônicas, a fim de desenvolver uma metodologia segura e prática para ser
empregada por indústrias de lacticínios, e II) caracterizar a diversidade
genotípica e fenotípica de cepas Propionibacterium lácteas autóctones de
fazendas do Campo das Vertentes, Minas Gerais, Brasil. Na primeira etapa
deste estudo, cepas de referência de Propionibacterium spp., culturas starter
comercial, e também amostras de queijo tipo Emmental foram submetidas a
enumeração de propionibactéria utilizando agar lítio glycerol (LG) e placas
PetrifilmTM Aerobic Count (AC) adicionadas de caldo LG. Os resultados obtidos
indicam a adequação das placas PetrifilmTM AC adicionadas de caldo LG para
enumeração de bactérias propiônicas, como uma ferramenta de monitoramento
na indústria láctea. Entretanto, devido ao tempo requerido para o isolamento e
purificação das bactérias isoladas a partir do sistema Petrifilm, o agar LG foi
selecionado para a segunda parte do trabalho. Em seguida, propionibactérias
lácteas foram isoladas de amostras de leite cru, solo, silagem e pastagem
provenientes de cinco fazendas. Os isolados foram identificados por Reação
em Cadeia de Polimerase (PCR) e a diversidade genotípica foi caracterizada
por Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Pulsed-field Gel
Eletrophoresis (PFGE). Cepas identificadas como P. freudenreichii foram
investigadas com relação à diversidade fenotípica baseado em atividades
enzimáticas (fermentação de lactose e redução de nitrato) e pela capacidade
por parte das cepas em formar compostos de aroma. Além disso, a relação
filogenética de cepas P. freudenreichii foi investigado por Multilocus Sequence
Typing (MLST), baseado em um esquema MLST existente. Do total de 71
isolados apresentando caracteríticas morfológicas compatíveis com o gênero
Propionibacterium, 50 foram efetivamente identificados como propionibactéria,
no qual 25 P. freudenreichii, 22 P. jensenii e 3 P. acidipropionici. RAPD e PFGE
distinguiram 27 e 31 perfis de bandas, respectivamente, demonstrando que o
PFGE foi mais efetivo na discriminação das amostras e sugerindo que cada
fazenda representa um nicho específico. Dentre as 18 cepas de P.
freudenreichii provenientes de 3 fazendas das 5 analisadas por MLST, dois
Sequence Type (ST) foram identificados, ambos anteriormente descritos no
esquema MLST para a espécie. Estes ST não foram relacionados a nenhuma
fonte específica e estavam aleatoriamente distribuídos na árvore filogenética.
As cepas demonstraram baixo nível de diversidade nucleotídica. Com relação
às atividades enzimáticas, dois fenótipos adicionais (“P+” e “P-“) foram
identificados, juntamente com os fenótipos clássicos (lac-/nit+ para P.
freudenreichii subsp. freudenreichii e lac+/nit- para P. freudenreichii subsp
shermanii). Não houve correlação entre a capacidade destas cepas em
fermentar a lactose e reduzir o nitrato. Adicionalmente, não se observou
correlação entre o perfil fenotípico e a capacidade de produção de compostos
voláteis. Estes resultados sugerem que o ambiente das fazendas e de
produção
de
leite
constitui
um
reservatório
natural
de
cepas
de
Propionibacterium. As cepas isoladas apresentam alto potencial para futuras
aplicações como cultura secundária para aplicação em queijos.
Palavras-Chave:
Bidiversidade, bactérias do ácido lático, identificação molecular, leite
Abstract:
Les bactéries propioniques laitiéres, particulièrement l’espèce P. freudenreichii,
présentent un rôle important dans la technologie de production des fromages
type suisse, depuis les produits de leur métabolisme contribuent au
développement de la flaveur et des ouvertures caractéristiques (les yeux) de
ces fromages. Ce travail a donc été effectué dans le but I) évaluer une
procédure alternative pour compter (faire le dénombrement des) les
propionibactéries, afin de développer une méthodologie fiable et pratique que
soit utilisable par les industries laitières, et II) caractériser la diversité
génotypique et phénotypique des souches de Propionibacterium laitière
autochtone de fermes laitières situées dans la région Campo das Vertentes,
Minas Gerais, au Brésil. Afin de metrre en place cette démarche, des souches
type Propionibacterium spp. et des cultures starter commercialles, ainsi que des
échantillons de fromages type Emmental ont été soumis au dénombrement des
propionibactéries en utilisant le milieu solide (agar) lithium glycérol (LG), et les
plaques PetrifilmTM aérobic count (AC) ajoutées de bouillon LG. Les résultats
obtenus indiquent la pertinence de plaques Petrifilm TM AC ajoutées de bouillon
LG pour le dénombrement des bactéries propioniques comme un outil de
contrôle de l'industrie laitière. Cependant, en raison du temps nécessaire pour
l'isolement et purification de bactérie à partir du système Petrifilm, le LG (milieu
solide traditionnel) a été utilisé dans la deuxième étape du travail. De plus,
propionibactéries laitiéres ont été isolés du lait cru, du sol, d’ensilage et d’herbe
de cinq fermes. Les isolats ont été identifiés par Réaction en chaîne par
polymérase (PCR), et leur diversité génotypique a été caractérisée par
Randomly
Amplified
Polymorphic
DNA
(RAPD)
and
Pulsed-field
Gel
Eletrophoresis (PFGE). Les souches identifiées comme P. freudenreichii ont été
étudiées en rélation à leur diversité phénotypique, ce qui a été basé sur
l’activités enzymatique (la fermentation du lactose et la réduction de nitrate), et
sur leur capacité à former des composés d’arôme. Puis, nous avons étudié la
relation phylogénétique des souches de P. freudenreichii par Multilocus
Sequence Typing (MLST), basé sur un schéma existant. Parmi les 71 isolats
présentant des caractéristiques morphologiques compatibles avec le genre
Propionibacterium, 50 ont été effectivement identifiés comme propionibactéries,
dont 25 étaient P. freudenreichii, 22 P. jensenii et 3 P. acidipropionici. RAPD et
PFGE ont distingés 27 et 31 profils de bandes, respectivement, ce qui
démontré que la PFGE a été plus efficace dans la discrimination des
échantillons et cella a suggéré aussi que chaque exploitation a été représenté
un niche spécifique. Nous avons identifié 2 Sequence Type (ST), parmi les 18
souches de P. freudenreichii, en étant tous les deux ST déjà décrites
précédemment pour le schéma MLST pour l’espèce. Ces ST ne sont pas liés à
une source spécifique et ils ont été répartis au hasard dans l'arbre
phylogénétique. Les souches ont montré un faible niveau de diversité
nucléotidique entre les souches. Deux phénotypes supplémentaires («P+ » et «
P- ») ont été identifiés, ainsi que ceux classiques (lac-/nit+ par P. freudenreichii
subsp. freudenreichii et lac+/ nit- par P. freudenreichii subsp. shermanii). Il n'y
avait pas de corrélation entre la capacité de ces souches à fermenter le lactose
et réduire le nitrate. De plus, aucune corrélation n'a été trouvée entre le profil
phénotypique et la capacité à produire des composés volatils. Ces résultats
suggèrent que l'environnement des exploitations laitières et la production de lait
constitue un réservoir naturel de souches de Propionibacterium. Les souches
isolées présentent un potentiel d’application future en tant que culture
secondaire pour la production de fromages
Keyword:
Bidiversidade, lactic acid bacteria, molecular identification, milk