Foram analisados exemplares de peixes das espécies Characidium cf. fasciatum, C. cf. zebra, C. cf. lagosantense, Characidium sp. e três amostras de C. cf. gomesi, representantes da subfamilia Characidiinae e uma amostra de Crenuchus spilurus, representante de Crenuchiinae, com o uso de técnicas citogenéticas convencionais por coloração com Giemsa, localização das RONs pela impregnação com Nitrato de prata, bandamento C e moleculares, de hibridação in situ fluorescente com sondas de DNAr 18S e 5S, sondas produzidas a partir do cromossomo sexual W e uma sonda produzida a partir do genoma de C. cf. zebra, com ênfase nas sondas produzidas a partir do cromossomo sexual W. Todas as espécies de Characidium apresentaram número diplóide de 50 cromossomos, com predominância de cromossomos dos tipos meta e submetacêntricos, tendo sido observada também a ocorrência de cromossomos supranumerários em uma amostra de C. cf. gomesi e a presença de um sistema de cromossomos sexuais do tipo ZZ-ZW nas espécies Characidium cf. gomesi, Characidium cf. fasciatum, Characidium sp. As espécies Characidium cf. zebra, Characidium cf. lagosantense e Crenuchus spilurus não apresentaram cromossomos sexuais diferenciados. A técnica de pintura cromossômica utilisando sondas produzidas a partir de cromossomos microdissecados e amplificação por DOP-PCR foi realizada para testar a homeologia dos cromossomos sexuais Z e W encontrados em sete amostras de Characidium. Foram produzidas sondas a partir do cromossomo W de Characidium cf. gomesi (DCg) e de Characidium cf. fasciatum (DCf). As sondas mostraram sinais de hibridação nos cromossomos Z e W em Characidium cf. gomesi, Characidium cf. fasciatum, Characidium sp., evidenciando homeologias entre os cromossomos sexuais existentes e uma possível origem comum deste sistema de diferenciação sexual nestas espécies. Por outro lado, em Characidium cf. zebra, Characidium cf. lagosantense e Crenuchus spilurus a hibridação com as sondas DCg e DCf não revelou marcações nos cromossomos, apontando que a origem do cromossomo W possívelmente tenha ocorriso após a cladogenese dos ancestrais dos dois grupos de espécies do gênero Characidium analisadas. Sete sequêcias de DNA presentes no cromossomo W de C. cf. gomesi (CgW1, CgW2, CgW4, CgW6, CgW9, CgW13 e CgW34) foram isoladas e caracterizadas mas não apresentaram similaridade com sequências previamente conhecidas. Foi observado que na população de C. cf. gomesi do córrego Alambari a sequência CgW4 estava presente apenas nos cromossomos Z e W dos indivíduos estudados, enquanto nos indivíduos coletados no Córrego Águas da Magdalena, esta sequência estava presente tmabém nos cromossomos supranumerários. Os resultados mostraram que os cromossomos B de C. cf. gomesi compartilham sequências com os cromossomos Z e W, sugerindo uma origem intra-específica e possivelmente relacionada ao processo de diferenciação dos cromossomos sexuais nesta espécie. A amostra de Crenuchus spilurus apresentou número diplóde de 38 cromossomos (12m + 04sm + 02st + 20a), com as RONs identificadas no par nove pela prata e pela sonda de DNAr 18S estando, contudo, localizadas em compartimentos cromossômicos distintos do DNAr 5S, que foi observado em dois pares cromossômicos. A análise da heterocromatina constitutiva por bandamento C revelou regiões heterocromáticas no braço curto do par subtelocêntrico número nove e nas regiões pericentroméricas de vários cromossomos acrocêntricos. Não foi observado polimorfismo ligado ao sexo nos exemplares desta espécie. Considera-se que os estudos realizados permitiram um melhor entendimento sobre a estruturação do material genético dos cromossomos autossômicos, cromossomos sexuais e cromossomos B destas espécies, fornecendo também subsídios para o melhor entendimento do processo de diferenciação cromossômica nas espécies estudadas.